產(chǎn)品及特點：
EB 病毒（Epstein-Barr Virus，EBV，EB 病毒）又叫人皰疹病毒 4（Human Herpesvirus 4, HHV-4)，它是皰疹病毒科嗜細(xì)胞病毒屬的成員，基因組為 DNA。EB 病毒具有在體內(nèi)外專一性地感染人類及某些靈長類 B 細(xì)胞的生物學(xué)特性。人是 EB 病毒感染的宿主，主要通過唾液傳播。無癥狀感染多發(fā)生在幼兒，3～5 歲幼兒 90%以上曾感染 EB 病毒，90%以上的都有病毒抗體。EB 病毒是傳染性單核細(xì)胞增多癥的病原體，此外 EB 病毒與鼻咽癌、兒童瘤的發(fā)生有密切相關(guān)性，被列為可能致癌的人類腫瘤病毒之一。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測 EB 病毒的試劑盒。
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)EB病毒高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他病毒 DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。
規(guī)格及成分：
|
編號 |
成分 |
規(guī)格 |
|
試劑一 |
2×Probe qPCR MagicMix |
500μL（本色蓋） |
|
試劑三 |
熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL（黃蓋） |
|
試劑二 |
EB病毒qPCR引物混合液 |
100μL（白蓋） |
|
試劑四 |
EB病毒qPCR探針 |
50μL（棕色管） |
|
試劑五 |
EB病毒qPCR陽性對照照(1×10E8/μL) |
50μL（紅蓋） |
|
|
使用手冊 |
1份 |
低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
自備試劑：
樣品DNA。
使用方法：
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）：
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。
6. 放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
EB病毒探針法熒光定量PCR試劑盒
二、樣品DNA的制備：
7. 如果有 N 個樣品，設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）：
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個 PCR管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加）：
|
成份 |
N+2個樣品管 |
PCR陰性對照管 |
標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管(2-7管) |
|
2×Probe qPCR MagicMix |
10μL |
10μL |
各10μL |
|
EB病毒qPCR探針 |
1μL |
1μL |
各1μL |
|
EB病毒qPCR引物混合液 |
2μL |
2μL |
各2μL |
|
N+2個待測DNA模板 |
7μL |
-- |
-- |
|
超純水 |
-- |
7μL |
-- |
|
第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7號） |
-- |
-- |
各7μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管） |
|
過程 |
溫度 |
時間 |
|
預(yù)變性 |
95℃ |
3 min |
|
PCR反應(yīng)40個循環(huán) |
95℃ |
15 sec |
|
60℃ |
1 min（采集FAM通道的熒光信號） |
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct值小于 40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。