產(chǎn)品及特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據(jù)龍眼肉保守序列設(shè)計(jì)的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。
3. 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。
4. 一管式熒光定量 PCR 檢測，避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。
規(guī)格及成分：
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編號(hào) |
成分 |
規(guī)格 |
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試劑一 |
2×qPCR MagicMix |
500 μL(棕色管) |
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試劑二 |
熒光 PCR 專用模板稀釋液 |
1 mL(黃蓋) |
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試劑三 |
龍眼肉染料法PCR 引物混合液 |
100 μL(白蓋) |
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試劑四 |
龍眼肉染料法PCR 陽性對(duì)照(1×10E8 /μL) |
50 μL(紅蓋) |
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試劑五 |
DNA 病毒裂解液(試用裝) |
15 次(9 mL) |
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使用手冊(cè) |
1 份 |
低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。
自備試劑：
DNA模板、10×ROX(根據(jù)機(jī)型決定，具體見使用方法)。
使用方法：
一、稀釋PCR陽性對(duì)照(以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例)：
1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對(duì)照。
2. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液(用帶芯槍頭，下同)。
4. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備：
8. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC(樣品制備陽性對(duì)照)，一個(gè)是 NC(樣品制備陰性對(duì)照)?？梢杂?10μL 上步制備的 PCR 陽性對(duì)照的第 4號(hào)(濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝)或第 5 號(hào)(濃度為 1×10E5拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 10 萬拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品，則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。
9. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級(jí)版柱式病毒 DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送 15 次一管式病毒DNAout。
龍眼肉染料法PCR鑒定試劑盒
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)(20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行)：
10. 如果只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照。如果做 2-3 次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加 2 或 3 倍。
11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后加)：
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成分 |
樣品管 N+2個(gè) |
PCR陰性對(duì)照管 |
PCR陽性對(duì)照管(2-7管) |
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2×qPCR MagicMix(棕色管) |
10μL |
10μL |
各10μL |
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龍眼肉PCR引物混合液(白蓋） |
2μL |
2μL |
各2μL |
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自備10×ROX(見注) |
2μL |
2μL |
各2μL |
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N+2待測樣品DNA模板 |
6μL |
不加 |
不加 |
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第7步所得PCR陽性對(duì)照稀釋液(2-7號(hào)) |
不加 |
不加 |
各6μL2號(hào)樣到2號(hào)管,3號(hào)樣到3號(hào)管 |
12.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR(具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化)。
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過程 |
溫度 |
時(shí)間 |
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預(yù)變性 |
92℃ |
5分鐘 |
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PCR反應(yīng)30個(gè)循環(huán) |
94℃ |
60秒 |
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50℃ |
60秒 |
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72℃ |
60秒 |
具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時(shí)，吸收光譜在471nm，結(jié)合DNA時(shí)的吸收光譜在500nm，發(fā)射光譜在530nm。信號(hào)采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。
四、數(shù)據(jù)處理：
14.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
15. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。